ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠如何解決產(chǎn)生組織切片非特異性染色
1、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。
2、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;
4、 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;
5、 DAB孵育時間過長或濃度過高;
6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;
7、 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
1、首先排除抗體孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯，因此對于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先排除。
2、其次，DAB孵育時間是否太長?做出來那一次我是孵育8min，后來也是8-10min，我單獨做了一次實驗來排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時間的延長，會出現(xiàn)非特異性背景著色。
3、zui后，血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min，所以我單獨做了一次實驗用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。
4、對PBS清洗不斷地延長時間和增加次數(shù)，甚至*參照試劑盒說明書來進(jìn)行操作(我以前一般一抗4度且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、Sp反應(yīng)37度30min)，以及過氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。
5、步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點)，奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好。--因為抗原抗體反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，ELISA試劑盒進(jìn)口大鼠結(jié)果是前者偏酸性(<6、0)，而后兩者均在7、5左右。
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